پايان نامه طبقه بندي ژنوتيپ‌ها از لحاظ ژن‌هاي آنتي‌پورتر

پايان نامه طبقه بندي ژنوتيپ‌ها از لحاظ ژن‌هاي آنتي‌پورتر

چكيده

   به منظور بررسي مكانيزم­هاي مقاومت به شوري در مرحله جوانه­زني در ارقام گندم براي استفاده در برنامه­هاي دورگ­گيري و اصلاح نباتات، 6 رقم از مناطق كويري و شمال ايران بنام­هاي (كوير، ارگ، بم، آرتا،مرواريد و دريا) انتخاب و در پنج سطح شوري شامل (0، 1/0، 2/0، 3/0 و 4/0 ميلي­مولار) كشت گرديد. در هر روز تعداد بذور جوانه زده و نيز پس از 12 روز طول كلئوپتيل اندازه­گيري شد. شاخص­هاي جوانه­زني از طريق فرمول المدرس() محاسبه و نهايتاً ارقام حساس و مقاوم شناسايي شد. در ادامه، در 5 رقم ميزان بيان نسبي ژنهاي آنتي پورتراز طريق روش كمي بيان نسبي ژن (Real Time PCR) ارزيابي شد. نتايج نشان داد كه بيان نسبي ژن­هاي مربوط به آنتي پورترهاي TaNHX1 و TaNHX2 در ارقام مقاوم و ارقام حساس تفاوت معني دار داشت، بطوريكه با افزايش سطح شوري (استرس) آنتي پورتر TaNHX2 در ارقام مقاوم بيشتر بيان شده بود. بنابراين در ارقام مقاوم مورد مطالعه بيان نسبي TaNHX2 نسبت به TaNHX1 در مكانيزم مقاومت نقش بيشتري داشته است. ارقام حساس با وجود افزايش بيان ژ­ن­هاي TaNHX1 و TaNHX2 در سطوح پايين شوري ولي ميزان بيان آنها كمتر از ارقام مقاوم بوده و كارايي زيادي در ايجاد مقاومت نداشته است. بيان نسبي ژن­هاي  TaNHX1 و TaNHX2 و رابطه آن با شاخص­هاي جوانه­زني در دو رقم تفاوت داشت كه اين نتيجه در اثر وجود اثر متقابل ژنوتيپ × سطوح شوري حاصل شده است. بررسي بيان نسبي ژن­ TaNHX2 مي­تواند در ارقام مقاوم در سطح شوري نسبتاً بالاي 3/0 ميلي­مولار بعنوان ماكر استفاده شود.

كلمات كليدي: ژن‌هاي آنتي‌پورترNa⁺/H⁺، شوري، گندم

مقدمه

با توجه به ‌اينكه جمعيت دنيا به طور فزاينده‌اي روبه افزايش است و دانشمندان پيشبيني كرده­اند كه در سال 2030 ميلادي جمعيت كره زمين به 10 ميليارد نفر مي‌رسد، اكنون اين سوال پيش مي‌آيد كه براي تهيه و تأمين مواد غذايي براي چنين جمعيتي چه بايد كرد و چه چاره‌هايي انديشيد (رنجبر، 1392). غلات مهم‌ترين گياهان زراعي هستند (امام، 1383)، توليد كل غلات جهان 8/1 ميليارد تن است كه بيشترين ميزان آن (حدود 500 تا 600 ميليون تن) به گندم اختصاص دارد و از نظر سطح زير كشت و توليد ساليانه نيز گندم در درجه اول اهميت قرار دارد (صفي خاني، 1386).

گندم گياهي است كه در سراسر دنيا از كرانه­هاي قطبي تا حوالي استوا كشت مي‌شود (نجفي‌ميرك و شيخي‌گرجاني، 1384). كشت و همچنين رشد و نمو اين نبات در بسياري از نقاط دنيا و در شرايط آب و هوايي مختلف امكان‌پذير مي‌باشد (شيخ زاده مصدق، 1392). گندم اولين و مهم‌ترين گياه زراعي تأمين كننده نياز‌هاي غذايي بشر است كه حدود صد قرن پيش اهلي شده است. با توجه به رشد روز افزون جمعيت جهان اهميت غذايي و اقتصادي گندم روز به روز بيشتر مي‌گردد (خدابنده، 1376). بنابراين ضرورت افزايش توليدات غذايي، جهت تامين نياز‌هاي جمعيت روز افزون اجتناب ناپذير مي‌باشد (رنجبر، 1392). مهم‌ترين مصرف گندم در جهان براي تغذيه انسان است و همچنين در پرورش دام و طيور، كاغذ سازي و بسياري از صنايع ديگر مورد استفاده قرار مي‌گيرد (خدابنده، 1376).

تنش در موجودات زنده به معني انحراف از شرايط مطلوب براي زندگي تعريف مي‌شود. هر عامل محيطي كه باعث ايجاد صدمه يا خسارت در موجود زنده شود، تنش بيولوژيك  نام دارد. تنش از نظر علم بيولوژي به نيروهايي گفته مي‌شود كه از طريق تأثير بر واكنش‌هاي طبيعي گياه، باعث كاهش نمو، رشد و توليد و كاهش عملكرد گردد (فيشر، 1989).

تنش شوري يكي از تنش‌هاي غيرزنده است كه بشر از هزاران سال پيش تاكنون با آن دست به گريبان بوده است. شور شدن اراضي از زماني آغاز گرديد كه انسآن‌ها شروع به عمليات كشاورزي كردند و توسعة سريع و نامناسب سيستم‌هاي آبياري در مقياس بزرگ منجر به گسترش پديدة شوري در اراضي قابل كشت گرديد (خوش‌خلق‌سيما و عسگري، 1380).

هيچ قاره و اقليمي عاري از خاك‌هاي متاثر از شوري با منشاء اوليه يا ثانويه نيست. اين خاك‌ها حدوداً يك ميليارد هكتار از سطح زمين را پوشانيده‌اند كه 75 ميليون هكتار از آن در جنوب غربي آسيا قرار دارد. ايران با 27 ميليون هكتار اراضي شور در مقام اول كشورهاي اين ناحيه قرار دارد و پس از آن هند و پاكستان به ترتيب با 8/23 و 5/10 ميليون هكتار مقام دوم و سوم را دارند (صادقي و همكاران، 1385).

در ميان اندام‌ها و مراحل مختلف رشد گياه شوري بيشترين اثر را روي جوانه­زني بذر و ريشه‌هاي كم عمق دارد. زيرا نمك عمدتاً در لايه‌هاي بالاي خاك تجمع مي‌كند (سوماني، 1991). جوانه‌زدن پديده بسيار پيچيده‌اي است كه طي آن تغييرات فيزيولوژيك و بيوشيميايي بسياري در بذر انجام مي‌گيرد تا جنين فعال گردد. شوري ابتدا جذب آب را كاهش مي‌دهد؛ زيرا سبب كاهش پتانسيل اسمزي آب خاك مي‌گردد، از طرف ديگر سبب سميت يعني تغيير فعاليت آنزيمي، اختلال در متابوليسم پروتئين‌ها، بهم ريختن تعادل هورموني و كاهش استفاده از ذخيره بذر مي‌شود (به نقل از ميرزا معصوم زاده، 1392).

وجود تنوع ژنتيكي براي موفقيت در اصلاح‌ نباتات ضروري است. به طوري كه انتخاب موفقيت آميز ژنوتيپ‌هاي برتر از داخل توده‌هاي مورد اصلاح بستگي به وجود تنوع ژنتيكي دارد و بدون آن هيچ پيشرفتي در اصلاح امكان‌پذير نيست (خالدي، 1373 به نقل از مطلوبي اقدم، 1387). براي استفاده از سرمايه عظيم تنوع ژنتيكي اطلاع از ماهيت و ميزان تنوع در ژرم پلاسم از اهميت زيادي در برنامه‌هاي اصلاحي برخوردار است زيرا والديني كه از لحاظ ژنتيكي متفاوت هستند هيبريد با هتروزيس بيشتر توليد مي‌كنند و احتمال بدست آوردن نتاج تفرق يافته برتر از والدين را افزايش مي‌دهند (باقري و همكاران، 1375).

براي استفاده از زمين‌هاي شور در كشاورزي سه امكان وجود دارد:

1-         تغيير محيط: مشخص است كه جبران كمبود يك عنصر در خاك به مراتب آسان‌تر از رفع مازاد يك عامل مي‌باشد روش‌هاي مختلفي براي رفع شوري خاك وجود دارد ولي همگي آن‌ها پرهزينه هستند.

2-         تغيير گياهان مورد كشت يا تعويض گياهان زراعي حساس به شوري با گونه‌هاي سازگار به شوري يا هالوفيت‌ها.

3-          اصلاح گياهان زراعي جهت افزايش تحمل شوري از طريق منابع ژنتيك موجود كار با استفاده از روش‌هاي كلاسيك اصلاح‌نباتات و روش‌هاي نوين مهندسي ژنتيك (يئو، 1989 و خوش‌خلق‌سيما و عسكري، 1380).

طي دهه‌هاي گذشته تلاش‌هاي فزاينده‌اي براي بدست آوردن ژنوتيپ‌هاي متحمل به شوري كه قادر به رشد در محيط‌هاي شور باشند، صورت گرفته است. با اين حال ژنوتيپ‌هاي زراعي اصلاح شده براي تحمل شوري وجود دارد كه به عنوان يك راه حل اقتصادي در اكوسيستم‌هاي شوري مورد بهره برداري قرار گرفته‌اند (كوليس، 1993).

از آنجايي كه فنوتيپ گياه از اثر توام ژنوتيپ و محيط شكل مي‌گيرد، اثر شوري توام با اثر ساير عوامل محيطي در يك گياه جلوه‌گر مي‌شود از اين رو بررسي وراثت‌پذيري تحمل شوري در گياهان مشكل است (شاتون، 1984).

بررسي مكانيزم‌هاي مولكولي مقاومت به شوري در ارقام متفاوت، اين امكان را مي‌دهد كه شناخت كاملي از زمينه ژنتيكي ارقام بدست آورده و از آن‌ها به‌صورت آگاهانه در توليد ارقام مقاوم استفاده كرد. منابع مقاومت به شوري توسط TFها، ژن‌هاي Nax1 وNax2، ترانسپورترها، منابع آنتي‌اكسيدان‌ها (ضعيفي‌زاده و همكاران، 2012) گزارش شده‌اند. شناخت ارقام و ژنوتيپ‌هاي اصلاح شده ايراني از لحاظ پتانسيل‌هاي منابع مقاومت به شوري از جنبه‌هاي ملكولي مخصوصاً ترانسپورترهاي H⁺/Na⁺ما را در اصلاح و استفاده از آن‌ها دربرنامه‌هاي تلاقي و دورگگيري هاي موفق ياري نمايد.

1-2- پيشينه پژوهش

تنش شوري يكي از مشكلات عمده كشاورزي به ويژه در مناطق خشك و نيمه خشك مي‌باشد. اثرات منفي ناشي از اين تنش مانع رسيدن گياهان به حداكثر پتانسيل عملكرد مي‌گردد (پارديا و داس، 2005). اثرات منفي عمده ناشي از شوري در گياهان به دليل افزايش غلظت يون‌هاي سمي در گياه و ايجاد عدم تعادل يوني همراه با تنش كم آبي در گياه است (بلوموالد و آپسه، 2000). سديم يكي از يون‌هائي است كه با افزايش غلظت آن در سيتوپلاسم گياهان تحت تنش شوري موجب اختلال در فرآيندهاي بيوشيميايي و فيزيولوژيكي گياه مي‌شود (تستر و دونپورت، 2003). در حقيقت افزايش يون سديم اختلال در جذب و عمل يون پتاسيم و نتيجتاً سبب افزايش نسبت Na⁺/K⁺ مي‌شود كه‌اين موضوع اكثراً فرآيندهاي فيزيولوژيك گياه را تحت تأثير قرار مي‌دهد (خان و عبدالله، 2003). بنابراين جهت تحمل تنش شوري ضروري است كه گياه بتواند غلظت يون سديم را در سيتوپلاسم پايين نگه دارد.

در گياهان، يون سديم به واسطه فعاليت آنتي‌پورترهاي  Na⁺/K⁺از سيتوزول به بيرون رانده مي‌شود. آنتي‌پورترهاي واكوئلي با فرستادن يون‌هاي سديم به درون واكوئلي گياه آن را از سيتوزول دور مي‌كنند. تحت شرايط تنش شوري، بيان ژن رمز كننده آنتي‌پورترهاي واكوئلي افزايش مي‌يابد كه نشان از اهميت اين پروتئين در مكانيزم‌هاي تحمل تنش دارد (فوكودا و همكاران، 1996). با تحقيقات انجام شده در گياهان مشخص گرديده كه آنتي‌پورترهاي واكوئلي توسط يك خانواده چندژني رمز مي‌شوند براي مثال در ذرت و آرابيدوپسيس شش ايزوفرم براي اين ژن وجود دارد (زورب و همكاران، 2005).

همانگونه كه ذكر گرديد گزارش‌هاي متعددي دال بر اهميت آنتي‌پورترهاي واكوئلي در تحمل تنش شوري وجود دارد كه در اين ميان ژن‌هاي رمز كننده‌اين پروتئين در گياهآن‌هالوفيت جايگاه ويژه‌اي دارند (پارديا و داس، 2005؛ يوكويي و همكاران، 2002 و زانگ و همكاران، 2005). هالوفيت‌ها با پايين نگه داشتن غلظت يون‌هاي سمي ‌از جمله سديم در سيتوزول تحت شرايط تنش اين امكان را براي خود فراهم مي‌آورند كه بتوانند تنش را به خوبي پشت سر بگذارند (پارديا و داس، 2005). بنابراين ژن‌هاي رمز كننده آنتي‌پورترهاي واكوئلي در گياهآن‌هالوفيت مي‌توانند نامزدهاي مناسبي براي اصلاح گياهان زراعي مهم و حساس نسبت به تنش شوري باشند. با استفاده از اين ژن‌ها از طريق مهندسي ژنتيك مي‌توان گياهان زراعي متحمل نسبت به تنش شوري ايجاد نمود، علاوه بر اين مي‌توان با بررسي و تجزيه و تحليل توالي نوكلئوتيدي اين ژن‌ها و توالي اسيدآمينه‌اي پروتئين‌هاي رمزشونده توسط آن‌ها و مقايسه آن‌ها با گياهان معمولي به درك بيشتري نسبت به توانايي هاي اين آنتي‌پورترها در مكانيسم تحمل دست يافت.

گياهان قادرند تنش را دريافت كرده و سيگنال تنش را به درون سلول خود انتقال داده و مكانيزم‌هاي سازگاري خود را فعال كنند. مكانيسم سازگاري گياهان به تنش هاي محيطي غالبا با تغيير بيان ژن‌هايشان همراه است. يكي از راه‌هاي بررسي الگوي بيان ژن‌ها اندازه‌گيري ميزان رونوشت‌هاي mRNAكدشده از تك ژن به كمك روش‌هايي مانند ريزآرايه ،  SAGE,cDNAو AFLP است. براي مثال با استفاده از  cDNAتعداد 194 رونوشت  mRNAشناسايي شدند كه بيان شان تحت تنش شوري در آرابيدوپسيس پنج برابر افزايش يافت شده بود (موتواكي و همكاران، 2002). در تحقيق مشابه الگوي بيان ژن‌هاي برنج تحت تنش شوري مورد بررسي قرار گرفت و نشان داد كه بيش از 10% ژن‌ها در فاز اوليه تنش شوري كاهش يا افزايش بيان نشان مي‌دهند (كاوازاكي و همكاران، 2001). با وجود قدرت بالاي روش‌هاي ذكر شده در تجزيه بيان ژن‌ها، هيچ يك از اين روش‌ها اطلاعات كمي و كيفي از فرآورده نهايي ژن‌ها (پروتئين‌ها) در اختيار قرار نمي‌دهند.

ماژول و همكاران (2000) در بررسي اثر تنش شوري بر روي ريشه‌هاي دو رقم گندم مقاوم و حساس، 9 پروتئين پاسخ دهنده را شناسايي كردند. داداشي دوكي و همكاران (2006) به بررسي الگوي بيان پروتئين در پانيكول برنج تحت تنش شوري پرداختند، در اين تحقيق ژنوتيپ  IR651به عنوان مقاوم به شوري انتخاب شده و 12 روز پس از اعمال تنش شوري نمونه­گيري از پانيكول‌هاي جوان برنج انجام گرفته است. نمونه‌هاي پانيكول در سه سطح از لحاظ اندازه تقسيم‌بندي شدند. الگوي بيان اين سه گروه تجزيه شده و بيان 13 پروتئين در هر سه گروه دچار تغيير بيان قابل ملاحظه‌اي شده بودند با شناسايي اين پروتئين‌ها بوسيله طيف سنجي جرمي، به عنوان آنتي‌اكسيدان‌ها و پروتئين‌هاي درگير در ترجمه، رونويسي، انتقال و سنتز  ATPتشخيص داده شدند. از آنجائيكه شناسايي منابع مولكولي مقاومت يا تحمل به شوري مي-تواند ما را براي استفاده از آنها در برنامه­هاي دورگ­گيري هدايت نمايد لذا اهداف اين تحقيق به شرح زير مي­باشد.

1-3- اهداف تحقيق

1- مقايسه و بيان ژن‌هاي آنتي‌پورتر ارقام حساس و مقاوم از لحاظ بيان اين ژن‌ها.

2- طبقه بندي ژنوتيپ‌ها از لحاظ ژن‌هاي آنتي‌پورتر

3- بررسي ميزان مقاومت به شوري در ژنوتيپ‌هاي مورد مقايسهدر مرحله جوانه‌زني

4- بررس رابطه بين ميزان بيان ژن‌هاي آنتي پورترو ميزان مقاومت به شوري در مرحله جوانه­زني

 - Biological Stress

  - Microarray