پايان نامه بررسي عفونت ريوي مايكوپلاسمايي ناشي از مايكوپلاسما مايكوئيديس واريته مايكوئيدس و مايكوپلاسما كاپري كولوم واريته كاپري كولوم در گوساله ها و بزها

عنوان كامل

بررسي عفونت ريوي مايكوپلاسمايي ناشي از مايكوپلاسما مايكوئيدس واريته مايكوئيدس و مايكوپلاسما كاپري كولوم واريته كاپري كولوم در گوساله‌ها و بزهاي كشتارشده به روش PCR

مقدمه

عفونت پلوروپنوموني واگير،‌ بيماري تحليل برنده تنفسي است كه با جاي گرفتن در طبقه‌بندي بيماريهاي سازمان جهاني كنترل بيماريهاي واگير، لزوم و اهميت شناسايي آن مشخص شده است. عامل اصلي اين بيماري، گونه مايكوپلاسما مايكوئيدس مي‌باشد كه تايپ كلوني كوچك آن[1] بطور اختصاصي به گله‌هاي گاو، خسارات فراواني ناشي از همه‌گيري گسترده و مرگ و مير فراوان تحميل كرده است.

[1]- Mycoplsma mycoides mycoides biotype Small Colony (MmmSC)

چكيده :

كلاستر مايكوپلاسما مايكوئيدس در برگيرنده مهمترين پاتوژنهاي تنفسي نشخواركنندگان است كه ساليانه، خسارات اقتصادي سنگيني بر صنعت دامپروري كشورهاي جهان وارد مي‌كند. اخيرا شيوعهاي بازپديدي از عفونتهاي پلوروپنوموني نشخواركنندگان در منطقه خاورميانه گزارش شده است. در اين شرايط تعيين وضعيت گله‌هاي كشور از نظر آلودگي به گونه‌هاي پاتوژن اين كلاستر، از اهميت خاصي برخوردار است. هنوز گزارشي از شناسايي و جداسازي گونه‌هاي درگير از عفونت پلوروپنوموني در ايران بدست نيامده است. عدم برخورداري از خصوصيت پاتوگونوميك در نمونه‌هاي باليني و دشواريهاي فراوان جداسازي ميكروارگانيسم، به ضرورت شناسايي و بكارگيري روشهاي تشخيصي جايگزين افزوده است. 

خصوصيات كلي مايكوپلاسما

مايكوپلاسماها، جزو كوچك‌ترين پروكاريوت‌هايند (μm١٥-٠)  كه قادرند از فيلترهاي مخصوص باكتري (μm٤٥-٢٢/٠) عبور كنند. اين اجرام به دليل فقدان ديواره سلولي، اشكال پلي‌مورفيك دارند و به اشكال كروي (μm٣/٠-٩/٠)، رشته‌اي (تا μm١)،گلابي شكل، شاخه‌اي و مارپيچي  در زير ميكروسكوپ الكتروني ديده مي‌شوند. در واقع، بيشتر شبيه به فرم L باكتري‌ها مي باشند.ارگانيسم از سه ارگانل شامل غشا سلولي، ريبوزوم و مولكول حلقوي DNA تشكيل شده است. تصوير مايكوپلاسما در زير ميكروسكوپ الكتروني، شبيه فيلامان (بطري) است كه از دو انتها طويل شده است. اين اندامك‌‌هاي انتهايي[1]، محل اتصال به غشا يوكاريوت است كه داراي يك ساختمان مركزي ميله مانند[2] مي‌باشد و توسط غشا احاطه شده است (70).

[1]- Tip organelle

[2]- Rod like

مقاومت مايكوپلاسماها

اين اجرام توانايي توليد ديواره سلولي پلي‌مورفيك و پپتيدوگليكاني را دارند و از همين رو، به آن‌ها باكتري‌هايي  با نقص ديواره سلولي[1] اطلاق مي‌شود. آنتي‌بيوتيك‌هايي كه بر روي ديواره سلولي اثر مي‌كنند،(دسته بتالاكتامز) مانند پني‌سيلين و سفالوسپورين، آن‌ها را از بين نمي‌برند.

[1]- cell wall deficients ) CWDs)

طبقه‌بندي كلاستر مايكوئيدس 

اعضا اين كلاستر شامل مايكوپلاسما مايكوئيدس مايكوئيدس كلوني كوچك (MmmSC)، مايكوپلاسما مايكوئيدس مايكوئيدس كلوني بزرگ (MmmLC)، مايكوپلاسما كاپري‌كولوم كاپري‌پنوموني (Mccp)، مايكوپلاسما كاپري‌كولوم كاپري‌كولوم (Mcc)، مايكوپلاسما مايكوئيدس كاپري (Mmc)، سروتيپ ٧ سويه گاوي (M.bsg7)، مايكوپلاسما پوتري‌فيكنس (M.putrificans)، مايكوپلاسما كووتي (M.cowetti) و مايكوپلاسما يستي (M.yeasti) مي‌باشند. دو گونه آخر جز مايكوپلاسماهاي ساپروفيت اند كه بيماري‌زايي آن‌ها در شرايط عادي در نشخواركنندگان نامعلوم است و پوتري‌فيكنس از مبتلايان به سندروم نقص ايمني انسان نيز جدا شده است (47).

فاكتور حدت

علي‌رغم مطالعات گسترده‌ در اين زمينه، مكانيسم بيماري‌زايي MmmSC هنوز ناشناخته است. به هر حال، تئوري‌هايي وجود دارند كه به صورت تجربي مورد آزمايش قرار گرفته‌اند. در سال ١٩٧٦، نشان داده شد كه تزريق داخل وريدي كپسول MmmSC به گوساله‌ها، موجب ادم ريوي در مبتلايان به CBPP ميشود. از اين رو، عنوان شده است كه اثرات سمي كپسول برروي ديواره رگها ،بصورت مستقيم است (43).

كشت و رشد  گونه كاپري كولوم

محيطي كه به وسيله مك اون و مينت  براي كشت Mccp استفاده گرديد، به نام محيط[1] VFG ناميده شد كه شامل محيط كشتي مايع از عصاره كبد و سرم بز است. از محيط‌هاي جايگزين مناسب مي‌توان از محيط WJ، محيط Hay Flick اصلاح شده، محيط تريپتوز نوينگ نام برد (9).

[1]- Viande foie goat

اختصاصيت ميزبان

در شرايط طبيعي، بيماري CBPP در گاوهايي از گونه گاوسانان اتفاق مي‌افتد، هم‌چنين بيماري در بوفالو، ياك، بيسون و حتي گوزن،ديده شده است.  حساسيت طبيعي گاوها بين نژادهاي متعدد و افراد يك جمعيت متفاوت است. گاوهاي جوان تا زير ٣ سال ،نسبت به گاوهاي مسن مقاوم‌ترند. به نظر مي‌رسد كه نژاد BOS نسبت به ساير نژادها، به بيماري حساس‌تر باشد. علاوه بر اين، نژادهاي اروپايي نسبت به نژادهاي آفريقايي حساس‌تربنظر ميرسند. بهبودي پس از بيماري، منجر به مصونيت هميشگي مي‌شود.

فهرست

عنوان                                                  صفحه 

الف- مقدمه.............................................. 1

ب-چكيده                                                  3

فصل اول:كليات .......................................... 5                                                                                                                   

1- تاريخچه    .......................................... 6                                                                                                              

2- خصوصيات كلي مايكوپلاسما................................ 6

3- مقاومت مايكوپلاسماها.................................. 8

4- طبقه بندي مايكوپلاسماها............................... 9

5- طبقه بندي كلاستر مايكوئيدس............................ 12

6- فيلوژني............................................. . 14

7- ساختمان  ............................................ 15

1-7-ساختمان مايكوپلاسما مايكوئيدس ......................... 15

2-7- ساختمان مايكوپلاسما كاپري كولوم ..................... 17

8- بيولوژي مولكولي...................................... 19

9- توالي‌هاي تكراري...................................... 23

10- پروتئينهاي سطحي..................................... 25

11- فاكتور حدت.......................................... 30

12- آناليز پروتئين  .................................... 32

13- طبقه بندي سويه‌ها ................................... 34

14- مشخصات گونه مايكوئيدس............................... 35

15- كشت و رشد گونه مايكوئيدس ............................ 38

16- كشت و رشد گونه كاپري كولوم .......................... 41

1-16- محيط Thiacourt  .................................... 41

17- بيماري پلوروپنوموني واگير گاوان...................... 44

1-17- علائم باليني ...................................... 45                                      

2-17- علائم كالبدگشايي بيماري ............................ 47

3-17- پاتوژنز .......................................... 50

1-3-17- مكانيسمهاي مقابله با دستگاه ايمني................ 53

4-17- اختصاصيت ميزبان................................... 57

5-17- انتقال بيماري  ................................... 58

6-17- سير همه گيري ...................................... 59

1-6-17- مخزن............................................ 59    

2-6-17- راه انتقال...................................... 59

7-17- پيشگيري و كنترل................................... 60

1-7-17- اقدامات لازم براي حفاظت مناطق عاري از بيماري...... 61

2-7-17- اقدامات لازم هنگام شيوع بيماري.................... 62

3-7-17- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومي.................. 63

18- بيماري پلوروپنوموني واگير بزان ...................... 63

1-18- علائم باليني ...................................... 64

2-18- علائم كالبد گشايي.................................. 66

19- گونه مايكوپلاسما كاپريكولوم كاپريكولوم................ 69

1-19- سندروم MASKePs.................................... 70

2-19- علائم باليني....................................... 71

3-19- علائم كالبد گشايي.................................. 71

4-19- سندروم آگالاكتيه واگير............................. 73  

20- گونه مايكوپلاسما كاپري .............................. 73 

1-20- بيماريزايي ....................................... 73

2-20- علائم كالبد گشايي.................................. 74

21- سير همه‌گيري.......................................  75

1-21-مخزن............................................. ..  75

2-21-راه انتقال........................................   76

3-21-جمعيت ميزبان......................................  77

22-پيشگيري وكنترل .....................................    77

1-22- اقدامات لازم براي محافظت مناطق عاري از بيماري......   77

2-22- اقدامات لازم هنگام شيوع بيماري....................  78

3-22- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومي...................  78

23-واكسن..............................................  79

1-23-واكسن MmmLC ....................................    79

2-23-واكسن Mccp .......................................   79

3-23-واكسن Mcc  .......................................  79 79-اختصاصيت ميزبان در كلاستر مايكوئيدس  ..................  .........    80 

25-تشخيص افتراقي....................................... 80

1-25-شناسايي عامل بيماري زا ........................... ..      81

1-1-25-بررسي ميكروسكوپيك اگزوداي ريه از طريق تهيه اسمير يا برش بافتي  81

2-25- تشخيص آزمايشگاهي ................................  81

1-2-25- روش كشت و جداسازي.............................. 81

1-1-2-25- انتخاب نمونه ها ................................  82

2-1-2-25- آماده سازي نمونه ها ..........................    82

3-25- تستهاي بيوشيمي................................... 83

4-25- روشهاي سرولوژي................................... 85

1-4-25- عوامل موثر در آزمايشات سرولوژي ....................      85

2-4-25- تست مهاري رشد  ...................................  87

3-4-25- تست ايمونو فلورسانس ..............................  88

4-4-25- تست رسوب ژلي................................... .. 88

5-4-25- تست فيكساسيون كامپلمان ............................  89

6-4-25- تست ممانعت از هماگلوتيناسيون ......................  89

7-4-25- تست آگلوتيناسيون لاتكس.......................... 90

8-4-25- تست اليزاي رقابتي.............................. 91

9-4-25- ساير تستهاي تشخيصي............................. 94

5-25 - مشكلات روشهاي سنتي............................... 94

6-25- تشخيص با استفاده از PCR.......................... 95

فصل دوم: روش كار

26- روش كار ........................................... 101

1-26- جمع آوري نمونه ..................................... 101

1-1-26- مواد لازم.......................................... 101

2-1-26- بخش جمع آوري نمونه............................. 101

3-1-26- نمونه برداري .................................. 103

2-26- كشت و جداسازي نمونه ها............................ 104

1-2-26- مواد لازم ...................................... 104 

 2-2-26- طرز تهيه محيط كشت اختصاصي براي جداسازي مايكوپلاسماي نشخوار كنندگان         106

1-2-2-26- مواد لازم .................................... 106 

2-2-2-26- روش تهيه محيط كشت............................... 107

3-26- استخراج DNA مايكوپلاسما........................... 109

1-3-26- روش استخراج DNA از نمونه هاي ارسالي............... 109

4-26- فرايند PCR ...................................... 110

1-4-26- مواد لازم ...................................... 110

2-4-26- آماده سازي مواد جهت واكنش PCR .................... 112

1-2-4-26- افزوده سازي DNA نمونه‌ها ..................... 112

2-2-4-26- افزوده سازي DNA كلونيهاي جدا شده.............. 115

3-2-4-26- تهيه مخلوط اصلي اوليه......................... 115

3-4-26- پرايمرها....................................... 115

4-26- واكنش PCR....................................... 117

5-26- تهيه ژل الكتروفورز .............................. 118 

1-5-26- طرز تهيه محلول اتيديوم برمايد ..................... 119

6-26- الكتروفورز ......................................... 121

7-26- رويت باندهاي ايجاد شده .......................... 122 

فصل سوم: نتايج

27- نتايج ............................................. .. 124

1-27- جداسازي.......................................... 124

1-1-27- بررسي عملكرد محيط كشت........................... 124

2-1-27- نتايج كشت نمونه هاي ارسالي ..................... 124

1-2-1-27- نتايج روز پنجم  .............................. 125

2-2-1-27- نتايج روزهفتم تا دهم.......................... 125

3-2-1-27- نتايج روزپانزدهم............................. 126

2-27- نتايج  PCR  ....................................... 126

1-2-27- نتايج  PCR نمونه ها با پرايمر جنس .............. 126

2-2-27- تائيد كلوني هاي جدا شده......................... 127

3-2-27- نتايج  PCR نمونه ها با پرايمر كلاستر مايكوئيدس... 127

4-2-27- نتايج  PCR نمونه ها با پرايمر گونه آگالاكتيه..... 128

5-2-27- نتايج  PCR نمونه ها با پرايمر گونه مايكوئيدس كلوني بزرگ       129

3-27- نتايج كالبد گشايي................................ 130

1-3-27- معيار انتخاب .................................. 130

 فصل چهارم: بررسي نتايج

نمودارها................................................. 131

فصل پنجم: بحث

28- بحث .............................................. 139  

1-28- ضايعات كالبد گشايي.................................. 139

2-28- ميزان وقوع عفونت تنفسي مايكوپلاسما ................ 141

3-28- روش كشت.......................................... 142

4-28- روش  PCR  ....................................... 147     

5-28- فراواني گونه ها ................................. 152

29- خلاصه انگليسي....................................... 159

30- منابع ............................................. .. 160