پايان نامه مطالعه بيان ژنهاي كاسپاز3 وbaxدر سلولهاي lncap تحت القاي كمپلكس vo-salen

پايان نامه مطالعه بيان ژنهاي كاسپاز3 وbaxدر سلولهاي lncap تحت القاي كمپلكس vo-salen

چكيده­

در اين پژوهش كمپلكس معدنيVO-Salenو 5-Br-meso-VO-Salenاز تراكم آلدولي اتيلن دي آمين سالسيل آلدهيد در حضور تركيب واناديوم استيل استونات سنتز گرديد. ابتدا قدرت آنتي­اكسيداني Salen به وسيله­ي آزمون DPPHمورد ارزيابي قرار گرفت، نتايج نشان داد كه Salen قدرت آنتي­اكسيداني بسيار ضعيفي در مقايسه با كمپلكس­هاي واناديوم اكسيد آن دارد. ارزيابي اثرات سميت سلولي و ضد تكثيري كمپلكس­هاي Salen، VO-Salenو  5-Br-meso-VO-Salenنشان داد كه رشد سلول­هايLNCaP بعد از 16 ساعت تيماربه ترتيب با IC₅₀ برابر با 276/736 ، 42/428 و 55/403  ميكرومولار مهار گرديد. جهت ارزيابي رويداد مرگ برنامه­ريزي شده­ي سلولي، بيان كمي برخي از ژن­هاي كد كننده­ي فاكتورهاي مسير سيگنالينگ مرتبط با آپوپتوزيس سلولي مورد بررسي قرار گرفت يافته­هاي حاصل از اين آزمايش­ها نشان داد هر دو كمپلكسVO-Salenو  5-Br-meso-VO-Salen بيان كاسپاز 3 را به ترتيب به ميزان 82/1 و 16/7 برابر القا مي­كند، القاي بيان ژن bak توسط VO-Salenو نيز بيان ژن bax به­وسيله­ي 5-Br-meso-VO-Salen ممكن است باعث پليمريزاسيون پروتيئن­هاي  Baxو  Bakدر غشاي ميتوكندري شده و با بيان كاسپاز3 مسير ميتوكندريايي آپوپتوزيس ادامه يابد.

قسمتي از متن:

مرحله ي نسخه برداري معكوس در  RT-PCR

نسخه هاي mRNA مي توانند به طور قابل توجهي ايجاد ساختمان هاي ثانويه يا دايمر هايي نمايند كه توانايي آنزيم نسخه بردار معكوس در تبديل mRNA به cDNA را تحت تاثير قرار مي دهد. اين امر از

دقت روش RT-PCR  در تعيين كميت mRNA هاي مختلف مي كاهد(24).دو آنزيم نسخه­بردار معكوس رايج،AMV-RT[1]و [2]MMLV-RT هستند. AMV-RT با دوام­تر از MMLV-RT بوده و تا دماي 55 درجه­ي سانتيگراد پليمريزاسيون قابل توجهي را حفظ مي­نمايند(25) و مي­تواند به رفع مشكل ايجاد ساختمان ثانويه­ي RNA كمك نمايد. در مقابل MMLV-RTو مشتقات ساخته شده از آن توسط مهندسي ژنتيك به طور معني­داري فعاليت RNase H كمتري از AMV-RT دارند. از آنجا كه كاهش فعاليت RNaseH مي­تواند در سنتز محصولات با زنجيره بلند موثر باشد، در صورتي كه هدف از آزمايش تكثير مولكول cDNA با اندازه­ي كامل باشد، ممكن است MMLV-RT گزينه­ي بهتري محسوب گردد(26).

مرحله­ي نسخه­برداري معكوس را مي­توان با استفاده از پرايمر­هاي اختصاصي يا پرايمرهاي اليگو دي تي[3] انجام داد. استفاده از پرايمرهاي اختصاصي mRNA ، باعث كاهش تكثير زمينه­اي[4] مي­شود، حال آن­كه استفاده از اليگو دي تي تعداد مولكول­هاي mRNA كه مي­توانند از يك نمونه كوچك RNA مورد آناليز قرار گيرند را به حداكثر مي­رساند. پرايمرها مي­توانند باعث انحرافي بارز در تعدادكپي mRNA محاسبه شده شوند(27).

1-1-15-مرحله واكنش زنجيره­هاي پليمراز در RT-PCR

رايج­ترين آنزيم DNA پليمراز مورد استفاده DNA– پليمرازTaq[5] است كه داراي يك فعاليت نوكلئازي 3^´ → 5^´ بوده، اما فاقد فعاليت اگزونوكلئازي اصلاح خطا مي­باشد. از اين­رو، هنگامي كه صحت

فرايند،  هدف اصلي است استفاده از آن توصيه نمي­گردد. ثابت ميكائيليس آنزيم­هاي ديگر مي­توانند تا دو برابر متفاوت از Taq پليمراز باشند كه اين امر اثري مستقيم بر دماي اتصال[6] موثر پرايمر دارد(27)، اما در هر بار تغيير آنزيم، شرايط آزمايش بايد بهينه گردد و نتايج به­دست آمده ممكن است مستقيما قابل مقايسه نباشند.

غلظت هاي Mg²⁺ و dNTP نيازمند كنترل دقيق هستند، زيرا  Mg²⁺ فعاليت آنزيم را تحت تاثير قرار داده و مخلوط هاي dNTP نا متعادل باعث كاهش صحت عمل پلي مراز مي شوند. همچنين Mg²⁺ باعث افزايش دماي ذوب يا Tm در DNA دو رشته اي شده و توليد كمپلكس هايي محلول با dNTPs مي نمايد. از اين رو غلظت هاي بالاي dNTP ها در فعاليت پلي مراز اختلال نموده و اتصال پرايمر را توسط كاهش Mg²⁺  آزاد تحت تاثير قرار مي دهد(28).

1-1-16-مفاهيم Real Time PCR

1-1-16-1-خط پايه

چرخه هاي ابتدايي PCR كه طي آن تغيير اندكي در سيگنال فلورسنس ايجاد مي گردد ( معمولا چرخه هاي 3 تا 15 ) را خط پايه[7] مي نامند. تغييرات در شرايط واكنش و محيط مي تواند ميزان فلورسنس توليدي را تحت تاثير قرار دهد. به طور كلي سطح فلورسنس در هر چاهك متناسب با ميزان مولكول هدف موجود در آن است. سطوح فلورسنس ممكن است به دليل تغييرات در محيط واكنش كه ايجاد يك سيگنال زمينه اي مي نمايد ، دچار نوساناتي شود. سيگنال زمينه اي به ويژه طي چرخه هاي ابتدايي PCR و قبل از تجمع معني دار قطعه هدف مشهود تر است. طي اين چرخه هاي ابتدايي PCR ، سيگنال زمينه اي تمام چاهك ها براي تعيين سطح فلورسنس خط پايه در تمام تيوب هاي واكنش مورد استفاده قرار مي گيرد. در اين حالت، هدف تعيين زماني است كه تكثير قطعه مورد نظر به طور معني داري بيش از سيگنال زمينه اي شود. كه اين امر اندازه گيري دقيقتر فلورسنس را تسهيل مي نمايد(29).

1-1-16-2-چرخه آستانه[8]

در Real Time PCR واكنش ها توسط يك نقطه زماني ( يا يك سيكل PCR ) مشخص مي­گردد كه در آن تكثير قطعه هدف براي نخستين بار قابل تشخيص مي­گردد. اين معيار معمولا چرخه آستانه يا ( C_T ) ناميده مي­شود و زماني است كه شدت فلورسنس توليدي در اثر تكثير قطعات طي واكنش زنجيره اي پليمراز تا سطحي بالاتر از ميزان نسبتا ثابت فلورسنس زمينه اي افزايش مي­يابد. ملاك تعيين آستانه معمولا 10 برابر انحراف استاندارد Rn براي چرخه هاي اوليه PCR ( خط پايه ) است. آستانه بايد در ناحيه اي قرار گيرد كه PCR به صورت نمايي تكثير مي يابد. آستانه يك ميزان عددي است كه به هر واكنش نسبت داده شده و نشان دهنده يك نقطه از نظر آماري معني دار در بالاتر از خط پايه محاسبه شده مي باشد. براي بدست آوردن مقادير صحيح C­_T لازم است كه خط پايه دو چرخه قبل از ميزان C_T­ براي فراوان ترين نمونه قرار گيرد. به دامنه غلظت هاي آغاز كننده نمونه كه منجر به مقادير صحيح C_T مي­گردد، دامنه ديناميكي گفته مي شود(30).

فهرست مطالب

عنوان……………………………………………………………………… صفحه  

فصل اول: مقدمه و تاريخچه

1-مقدمه. 2

1 -1- سرطان. 2

1-1-1- ويژگي هاي اساسي سلول هاي سرطاني. 3

1-1-2-عامل­هاي سرطان. 3

1-1-3-ژنتيك سرطان. 4

1-1-3-3- ژن­هاي مهار كننده­ي تومور 7

1-1-5- بررسي سرطان پروستات از ديدگاه ژنتيكي. 8

1-1-6- مرگ سلولي آپوپتوزيس... 9

1-1-6-1- مسير آپوپتوزيس... 10

1-1-6-2- مسير خارج سلولي آپوپتوزيس... 11

1-1-6-2- مسير داخل سلولي آپوپتوزيس... 12

1-1-6-3- تنظيم مسير داخلي آپوپتوزيس از طريق پروتئين­هاي خانواده Bcl2. 13

1-1-7-ماشين آپوپتوتيك.. 15

1-1-7-1-كاسپازها و مسيرهاي آپوپتوتيك.. 16

1-1-7-1-1-ساختار كاسپازها و فعاليت آنزيماتيك.. 16

1-1-7-1-2-ساختار پروكاسپازها 16

1-1-7-1-3- ساختارهاي كاسپازهاي فعال. 17

1-1-7-1-4-كاسپازهاي عمل كننده 18

1-1-8-كمپلكس­هاي سالن. 19

1-1-8-1-كمپلكس­هاي نوع سالن. 20

1-1-8-1-1-جنبه­هاي عمومي كمپلكس­هاي سالن. 20

1-1-8-1-2-كمپلكس­هاي قابل حل در آب سالن. 21

1-1-8-1-3-كمپلكس آهن سالن. 21

1-1-9- Real Time PCR.. 22

1-1-10-مقايسه ي Real Time PCR و PCR  معمولي. 22

1-1-11 -فازهاي PCR.. 23

1-1-12-اصول RT-PCR به شيوه­ي معمولي و Real Time. 24

1-1-13- Real Time PCR يك مرحله­اي يا دو مرحله­اي. 24

1-1-14-مرحله ي نسخه برداري معكوس در  RT-PCR.. 25

1-1-15-مرحله واكنش زنجيره­هاي پليمراز در RT-PCR.. 26

1-1-16-مفاهيم  Real Time PCR.. 27

1-1-16-1-خط پايه. 27

1-1-16-2-چرخه آستانه. 27

1-1-16-3-منحني­هاي استاندارد 28

1-1-17-تئوري Real Time PCR.. 29

1-1-17-1- روش­هاي مختلف تعيين كميت به وسيله­ي  Real Time PCR.. 30

1-1-17-1-1-تعيين كميت مطلق. 30

1-1-17-1-2-روش منحني استاندارد براي تعيين كميت نسبي. 30

1-1-17-2-منحني ذوب و پرايمر دايمرها 30

1-1-17-2-1-پرايمر دايمرها 31

1-1-17-2-2-اثر پرايمر دايمرها بر PCR كمي. 32

1-1-18-رنگ­هاي متصل شونده به DNA.. 32

1-2- پيشينه­ي تحقيق. 33

  فصل دوم: مواد و روش­ها

2ـ مواد و روش‌ها 42

2ـ1ـ ابزار مورد استفاده 42

2ـ2ـ رده سلولي. 42

2ـ3ـ مواد مورد استفاده 42

2ـ3ـ1ـ بافر PBS. 42

2ـ3ـ2ـ محيط كشت RPMI 1640. 43

2ـ3ـ3ـ آنتي بيوتيك.. 43

2ـ3ـ4ـ محيط كشت فريزينگ.. 43

2ـ3ـ5ـ محلولMTT. 43

2ـ3ـ6ـ بافر گلايسين. 44

2ـ3ـ7ـ محلول استوك EDTA (5/0 مولار) 44

2ـ3ـ8ـ بافر X5 TAE (Tris- Acetic acid-EDTA) 44

2-3-9- بافر بارگذاري. 44

2-3-10- پرايمرهاي مورد استفاده 45

2-3-11-كيت Real Time PCR SYBR GeenI 45

2-3-12- سنتز كمپلكس VOS و 5BMVOS. 45

2-3-12-1- سنتز ليگاند شيف‌باز H₂L¹: 46

2-3-12-2- سنتز كمپلكسVOL¹: 46

2-3-12-3- سنتز ليگاند H₂L² 46

2-3-12-4- سنتز كمپلكس VOL² : 47

2-3-13- ساير مواد 47

2-4- روش­ها 48

2-4-1- تعويض محيط كشت.. 48

2-4-2- كشت مجدد سلول­ها 48

2-4-3- ذخيره و نگه­داري بلند مدت سلول­ها 49

2-4-4- حيات مجدد سلول­ها 51

2-4-5- شمارش سلول­ها با تريپان بلو 51

2-4-6- سنجش حيات سلول­ها با آزمون MTT. 52

2-4-7-استخراج RNA.. 52

2-4-8- الكتروفورز RNA بر روي ژل آگاروز 54

2-4-9-روش­هاي آشكار سازي RNA.. 54

2-4-10-RT-PCR.. 55

2-4-11-  واكنش Real Time PCR.. 56

2-6-3-  اجزاي تشكيل دهنده­ي واكنش در Real Time PCR.. 56

2-7- روش مورد استفاده براي تعيين كميت 57

فصل 3 نتايج

3- نتايج. 59

3-1- بررسي اثر آنتي اكسيداني salen. 59

3-2بررسي اثرات سيتوتوكسيسيتي و ضد تكثيري salen، VOS و 5BMVOS  بر روي لاين­هاي سلولي LNCaP  60

3-2-1 بررسي كسر ماندگاري سلول­ها با استفاده از آزمون MTT. 60

3-2-1-1-نتايج حاصل از آزمون MTT توسط تاثيرVOS بر روي لاين­هاي سلولي LNCaP. 60

3-2-1-2مطالعات مورفولوژيكي سلول­هاي تيمار شده با VOS استفاده از تصويربرداري با ميكروسكوپ اينورت   61

3-2-2- 1- نتايج حاصل از آزمون MTT توسط تاثير Salen بر روي لاين­هاي سلولي LNCaP. 62

3-2-2- 2- مطالعات مورفولوژيكي سلول­هاي تيمار شده با Salen 63

3-2-3-1- نتايج حاصل از آزمون MTT توسط تاثير 5BMVOS بر روي لاين­هاي سلولي LNCaP. 64

3-2-3-2- مطالعات مورفولوژيكي سلول­هاي تيمار شده با   5BMVOS. 65

3-3-  نتايج حاصل از استخراج و  بارگذاري RNA بر روي ژل آگارز 66

3-4- نتايج حاصل از Real Time PCR.. 68

3-4-1بررسي منحني ذوب مربوط به ژن GAPDH به عنوان ژن خانه­دار، كاسپاز3 ، bax و bak قبل و بعد از تيمار 68

3-4-2- منحني استاندارد ژن GAPDH ، كاسپاز3 ، bax و bak قبل و بعد از تيمار: 70

3-4-3- منحني تكثير ژن­ها 71

3-4-3منحني تكثير ژن­هاي ژنGAPDH  ،كاسپاز 3 ، bax و bak در دستگاه Real Time PCR از تيمار با  VOS  71

3-4-4منحني تكثير ژن­هاي ژنGAPDH  ،كاسپاز 3 ، bax و bak در دستگاه Real Time PCR قبل و بعد از تيمار با  5BMVOS. 72

3-4-5- نتايج حاصل از آناليز داده­ها با استفاده از روش2^-ΔΔCt 74

3-5- نتايج حاصل از بارگذاري PCR بر روي ژل آگارز 2 درصد. 75

3-5-1-نمونه­هاي تيمار شده با VOS. 75

3-5-2-نمونه­هاي تيمار شده با 5BMVOS. 75

3-6- اثر مهاري DMSO , Salen و VOS  بر روي آنزيم Taq DNA  پليمراز 76

فصل 4 : بحث و نتيجه­گيري

4- بحث.. ……….........78

منابع………….……………………………………………………………..83